Школа во Львове возникла при поощрении антиохийского патриарха Иоакима V. Константинопольский патриарх Иеремия II в особой грамоте 1590 годах предписывал, что во Львове должна быть школа братства Успения Пресвятой Богородицы, а в ней дети благочестивых и православных христиан должны учиться Священному Писанию, славянскому и греческому языкам и т. д. Решением Берестейского Собора от 24 июня 1594 г., Львовская братская школа была подчинена непосредственно киевскому Митрополиту. Также и польский король Сигизмунд III грамотой от 13 октября 1592 г. предоставил братству право иметь высшую школу и, кроме того, исключительное право печатать и продавать славяно-русские книги и свободно управлять своими делами.
Среди основателей школы при львовской Свято-Успенской православной церкви были активные деятели Львовского Успенского братства Кирилл Транквиллион-Ставровецкий, Арсений Элассонский, Стефан Зизаний, Ю. Рогатинец, И. Рогатинец, И. Красовский, К. Корнякт и др.
Школьный устав, разработанный львовскими мещанами и позже ставший основой для уставов остальных братских школ, предусматривал демократические основы организации школьного процесса, запрещавшего учителям относиться к «бедным ученикам» хуже, чем к сыновьям из богатых семей. Им определялся режим учебной деятельности учащихся, очерчивался круг их обязанностей, а также учителей, родителей и опекунов. Организация учебного процесса Львовской братской школы, зафиксированная в Школьном уставе, стала образцом для других братских школ — учебных заведений на территории исторической Руси (теперь — территории Украины, Белоруссии, Польши, Словаки, государств Прибалтики) XVII—XVIII веков.
На учëбу в школу принимались преимущественно дети львовских ремесленников и купцов, были также дети, в том числе, шляхетского сословия и князей, например, воеводич молдавских земель Пётр Могила, из других городов и сëл. Младшие школьники изучали грамоту, старшие («студенты») изучали старославянский, греческий и латинский языки, грамматику, риторику, поэтику, элементы философии, диалектику, а также арифметику, геометрию, начала астрономии, богословие и музыку.
